——小鼠心臟線粒體提取辦法

1、準備工作
打開離心機，將離心機運轉至低溫4℃并保持溫度。確保所有試劑緩沖液、實驗解剖工具、組織勻漿工具以及離心機轉子等均維持在4℃（或者在足夠的冰上操作）

1.1小鼠處死辦法
用頸脫位法處死實驗用小鼠
1.2線粒體提取流程
a) 實驗解剖，取出小鼠心臟部位，去除多余的血管結構、結締組織以及脂肪組織等，將處理好的心臟器官立刻放入BIOPS緩沖液中，整個過程在4℃環境（或冰上）進行
b) 在4℃條件下，將心臟器官放入有蓋培養皿中，根據實驗需要，單獨提取左心室或者使用整個心臟；操作者需小心去除血液凝塊等組織。將處理好的心臟放入10ml的玻璃燒杯中，加入1ml 4℃ BIOPS緩沖液（見2.1），取低溫剪刀，將實驗心臟組織剪碎至小塊
c) 將組織碎塊放入10ml手動玻璃研磨器中，加入2ml線粒體緩沖液B（見2.3），勻速手動研磨6-8次，形成心臟組織勻漿液
d) 將心臟組織勻漿液放入50ml離心管中，再加入3ml線粒體緩沖液B
e) 將上述液體在4℃、800g的條件下離心10min
f) 取出上清液，重新放置于新的50ml離心管中
g) 將該上清液再次在4℃、10000g條件下離心10min
h) 移除上清液，保留線粒體沉淀
i) 用500微升線粒體緩沖液A（見2.2）再次懸浮線粒體沉淀，然后，用線粒體緩沖液A將液體定容至2ml，形成線粒體懸浮液
j) 將線粒體懸浮液在4℃、10000g的條件下離心10min，保留沉淀
k) 用懸浮緩沖液（見2.4）再次懸浮線粒體沉淀，定容至200微升
l) 取5微升線粒體懸浮液直接加入O2k能量代謝測量儀的倉室中，用于線粒體呼吸能力的測量
m) 將剩余的線粒體懸浮液進行分裝，每20微升放入一個離心管，零下20℃保存，用于后續的分析（蛋白濃度定量等）
2.試劑
2.1 BIOPS器官組織緩沖液
常見于組織器官等實驗材料的緩沖液，詳細內容可咨詢工作人員
2.2線粒體緩沖液A

試劑	終濃度
甘露醇	225mM
蔗糖	75mM
EGTA	1mM
BSA	2.5mg/ml

 
2.3 線粒體緩沖液B
在10ml線粒體緩沖液A中加入5mg subtilisin
2.4 懸浮緩沖液
不帶有BSA的線粒體緩沖液A
 
3.參考文獻
1.Mela L , Seitz S (1979)Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue.Methods Enzymol 55:39-46
2.Fontana-Ayoub M, Fasching M, Gnaiger E (2016) Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondr Physiol Network 03.02(18):1-10.