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    O2k能量代謝測量儀的實驗材料制備方案

    ——小鼠心臟線粒體提取辦法


    1、準備工作
    打開離心機,將離心機運轉至低溫4℃并保持溫度。確保所有試劑緩沖液、實驗解剖工具、組織勻漿工具以及離心機轉子等均維持在4℃(或者在足夠的冰上操作)

    1.1小鼠處死辦法
    用頸脫位法處死實驗用小鼠
    1.2線粒體提取流程
    a) 實驗解剖,取出小鼠心臟部位,去除多余的血管結構、結締組織以及脂肪組織等,將處理好的心臟器官立刻放入BIOPS緩沖液中,整個過程在4℃環境(或冰上)進行
    b) 在4℃條件下,將心臟器官放入有蓋培養皿中,根據實驗需要,單獨提取左心室或者使用整個心臟;操作者需小心去除血液凝塊等組織。將處理好的心臟放入10ml的玻璃燒杯中,加入1ml 4℃ BIOPS緩沖液(見2.1),取低溫剪刀,將實驗心臟組織剪碎至小塊
    c) 將組織碎塊放入10ml手動玻璃研磨器中,加入2ml線粒體緩沖液B(見2.3),勻速手動研磨6-8次,形成心臟組織勻漿液
    d) 將心臟組織勻漿液放入50ml離心管中,再加入3ml線粒體緩沖液B
    e) 將上述液體在4℃、800g的條件下離心10min
    f) 取出上清液,重新放置于新的50ml離心管中
    g) 將該上清液再次在4℃、10000g條件下離心10min
    h) 移除上清液,保留線粒體沉淀
    i) 用500微升線粒體緩沖液A(見2.2)再次懸浮線粒體沉淀,然后,用線粒體緩沖液A將液體定容至2ml,形成線粒體懸浮液
    j) 將線粒體懸浮液在4℃、10000g的條件下離心10min,保留沉淀
    k) 用懸浮緩沖液(見2.4)再次懸浮線粒體沉淀,定容至200微升
    l) 取5微升線粒體懸浮液直接加入O2k能量代謝測量儀的倉室中,用于線粒體呼吸能力的測量
    m) 將剩余的線粒體懸浮液進行分裝,每20微升放入一個離心管,零下20℃保存,用于后續的分析(蛋白濃度定量等)
    2.試劑
    2.1 BIOPS器官組織緩沖液
    常見于組織器官等實驗材料的緩沖液,詳細內容可咨詢工作人員
    2.2線粒體緩沖液A
    試劑 終濃度
    甘露醇 225mM
    蔗糖 75mM
    EGTA 1mM
    BSA 2.5mg/ml
     
    2.3 線粒體緩沖液B
    在10ml線粒體緩沖液A中加入5mg subtilisin
    2.4 懸浮緩沖液
    不帶有BSA的線粒體緩沖液A
     
    3.參考文獻
    1.Mela L , Seitz S (1979)Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue.Methods Enzymol 55:39-46
    2.Fontana-Ayoub M, Fasching M, Gnaiger E (2016) Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondr Physiol Network 03.02(18):1-10.
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